β 2 微球蛋白( β 2 - MG )
[1] 是由100 個氨基酸組成的單鏈多肽, 分子量為 11.8 kD , 存在于除紅細胞和胎盤滋養(yǎng)層細胞以外的所有有核細胞中, 尤其在淋巴細胞和單核細胞存在豐富, 在其免疫應(yīng)答中起重要作用。已報道的測定 β
2 - MG 的方法有多種, 包括放射免疫分析法( RIA )、酶聯(lián)免疫吸附分析法( ELISA )、時間分辨熒光免疫分析法、免疫透射比濁法、膠乳免疫散射比濁法等, 其中有的測定方法檢測靈敏度低, 檢測方法繁瑣, 需要專門的儀器設(shè)備, 本研究采用簡單、快速、有效的免疫方法, 獲得了高效價、特異性的抗人 β
2 - MG 單克隆抗體, 為金標試劑盒的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 β 2 - MG 抗原 β 2 - MG 抗原購自 Sigma 公司。
1.1.2 動物與試劑 Balb/c 小鼠( 8~10 周齡, 雌性) 由甘肅省醫(yī)科院實驗動物中心提供; 小鼠骨髓瘤細胞 SP2/0 細胞購自中科院細胞庫; 弗氏佐劑、聚乙二醇( PEG )、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、氨基蝶呤均為Sigma 產(chǎn)品; 優(yōu)質(zhì)胎牛血清為中美合資蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品; DMEM 培養(yǎng)基為 Gibco 產(chǎn)品。
1.2 動物免疫
首先用卡介苗致敏小鼠, 1 周后將 β2 - MG 與弗氏完全佐劑等量混勻, 按 10 μg/ 只免疫小鼠, 初次免疫后每間隔 3 周再免疫 2 次, 抗原量翻倍加不完全佐劑等量混勻, 在小鼠頸背部皮下分次多點注射免疫小鼠, 細胞融合前 3 d 腹腔加強免疫 1 次。
1.3 細胞融合及篩選 [2~3]
取免疫小鼠的脾細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞按 8 ︰ 1 混合于融合管內(nèi), 1 000 轉(zhuǎn) /min 離心 10 min , 棄去上清, 振蕩細胞, 使兩種細胞盡量混合均勻, 然后緩慢滴加預(yù)熱的 50% PEG 溶液, 再緩慢加入無血清的 DMEM 培養(yǎng)基以終止融合, 靜置后再以 1 000 轉(zhuǎn) /min 離心 10 min , 棄上清后加入 HAT 培養(yǎng)基,使細胞懸浮并混勻, 加入適量飼養(yǎng)細胞, 分散于 96 孔培養(yǎng)板在 37℃ 、 5%CO 2 及飽和濕度下培養(yǎng), 第 6 天換液, 第 10 天開始檢測篩選。兩周后可換為 HT 培養(yǎng)基, 待克隆孔長至 1/3～1/2 時, 取培養(yǎng)上清液進行抗體檢測, 用間接法篩選陽性孔。將陽性孔用有限稀釋法進行 3 次亞克隆, 建株的雜交瘤細胞再擴大培養(yǎng)、凍存和制備腹腔積液。
1.4 腹腔積液制備和純化
正常 Balb/c 小鼠于 1 周前腹腔注射 0.5 ml 液體石蠟進行預(yù)處理, 再將制備好的雜交瘤細胞注射于預(yù)處理過的小鼠, 2×10 6 / 只, 約 10 d 后收集腹腔積液, 經(jīng) 50% 、 45% 硫酸銨鹽析沉淀和 Sepharey S- 300 凝膠柱分離純化。
1.5 間接 ELISA 檢測
[4]用 ELISA 法測不同單抗株的最大稀釋度和腹腔積液效價。用 β2 - MG 6.25 ng/ 孔包被聚苯乙烯微孔板, 37℃ 2 h , 4℃過夜, 用含 2.5% 的 BSA 封閉液封板, 37℃ 2 h 封閉, 拍干后分別加入倍比稀釋待測單抗的細胞上清、腹腔積液及純化后的單抗, 37℃ 0.5 h , 洗滌后加入羊抗鼠 IgG- HRP , 37℃ 0.5 h洗滌 3 次, 加底物顯色后用 2 mol/L 的硫酸終止反應(yīng), 用酶標儀測定 OD 450 值。 P/N≥3 為陽性, 否則為陰性。
1.6 免疫球蛋白 Ig 亞類測定
用鼠源單克隆抗體同型試劑( Sigma ) 來測定, 采用抗原介導(dǎo)的方法。用抗原按 1∶1 000 包被, 37℃ 作用 2 h , 直接加培養(yǎng)液上清, 室溫作用 2 h 。同型特定試劑按 1∶1 000 稀釋, 室溫作用 30 min , 洗板。將兔抗羊 - HRP 按 1∶2 500 稀釋, 室溫作用 15 min , 加底物反應(yīng)。
1.7 McAb 疊加試驗 [5]
在確定各 McAb 飽和值的基礎(chǔ)上, 在最適抗原包被的 96孔酶標板內(nèi), 加入一種飽和濃度 McAb1 , 37℃ 作用 0.5 h , 洗滌后加入另一種飽和濃度的 McAb2 , 同樣孵育洗滌; 加入1∶1 000 稀釋的羊抗鼠 IgG- HRP , 同樣孵育洗滌; 加入底物溶液顯色, 終止反應(yīng), 測定 OD 450 值, 計算增值指數(shù) (AI) 。按如下公式計算 : AI=[2×A(1+2)÷(A1+A2)-1]×100% 。式中 A1 為 McAb1的 OD 450 值; A2 為 McAb2 的 OD 450 值; A ( 1+2 ) 為 McAb1 疊加McAb2 的 OD 450 值。 AI ﹥ 50% 說明被測的兩株單抗的抗原結(jié)合位點不同, AI ﹤ 50% 說明被測的兩株單抗抗原結(jié)合位點相同。 AI 值越大, 抗原位點重疊的可能性越小。
1.8 抗體親和常數(shù)的測定
參照 Beatty 的方法 [6~7] , 即選用間接 ELISA 的方法測定,將抗原分別以 50 、 25 、 12.5 、 6.25 μg/L 包被, 加入倍比稀釋的抗體, 再加入 HRP 標記羊抗鼠 IgG 抗體, TMB 顯色測 OD 450值。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標, 以 OD 450 值為縱坐標, 每種抗體得出 4 條反應(yīng)曲線, 以每條曲線上部平坦段的 OD 450 值作為 100% , 在曲線上查出 50%OD 450 值相對應(yīng)的抗體濃度,按 Beatty 推導(dǎo)公式:Kaff= ( n- 1 ) /2 ( n[Ab′]t- [Ab]t )計算親和常數(shù)。
2 結(jié)果
2.1 雜交瘤細胞株的建立
采用上述免疫和融合方法, 進行了細胞融合, 共篩選出10 株雜交瘤細胞。經(jīng) 3 次亞克隆后, 100% 的檢測孔保持了分泌抗人 β2 - MG 抗體的能力。
2.2 單克隆抗體的效價
利用間接 ELISA 試驗對這些單克隆抗體的效價進行了測定。結(jié)果見表 1 。
2.3 抗體亞類
10 株雜交瘤細胞株, 其分泌的 McAb Ig 亞類結(jié)果見表 2 。
表 2 雜交瘤細胞株分泌的 McAb Ig 亞類
2.4 位點分析
通過 ELISA 疊加試驗對以上 10 株單抗進行位點分析,試驗發(fā)現(xiàn), 5 株單抗彼此疊加后的增值指數(shù)均大于 50% , 說明 5 株單抗的抗原識別位點均不相同。其中 McAb 7H5 和McAb 6E5 相互疊加的增值指數(shù)可達 96.8% , 配對良好。
2.5 親和常數(shù)測定
10 株雜交瘤細胞株, 選取其中 5 株進行親和常數(shù)的測定, 結(jié)果見表 3 。
表 3 雜交瘤細胞株親和常數(shù)
3 討論
獲得高質(zhì)量的單克隆抗體是檢測診斷試劑產(chǎn)品研制中最為基礎(chǔ), 也是最為主要的研究, 單抗的性能直接決定診斷試劑產(chǎn)品的質(zhì)量。而生物活性效價、抗原位點互補關(guān)系、親和常數(shù)及穩(wěn)定性是衡量一種單抗性能好壞最主要的性能指標,在單抗研究實踐中由于受諸多隨機因素影響, 要取得各項性能指標最優(yōu)難度較大。本文報道了 β2 - MG 單克隆抗體研究結(jié)果, 成功獲得了 10 株穩(wěn)定分泌抗人 β2 - MG 單克隆抗體的雜交瘤細胞株, 經(jīng)鑒定 10 株單抗特異性好, 親和力強, 抗體分泌穩(wěn)定, 其中有 2 株在生物活性效價、抗原位點互補關(guān)系、親和常數(shù)及穩(wěn)定性達到了最佳, 為 β2 - MG 診斷試劑產(chǎn)品研制
奠定了較好的基礎(chǔ)。
[ 參考文獻 ]
[1] 陳泮藻 . 實用放射免疫學(xué) [M]. 北京: 科學(xué)技術(shù)文獻出版社, 1989.421.
[2] Kohler G , Milstein C. Continues cultures of fuses cell secreting Antibody
if predefined specificity[J]. Nature, 1975 , 256: 495.
[3] Lane RD. A short duration polyethylene fusion technique for increasing
production of monoclonal antibody secreting hybridisms [J].J Immune
Method, 1985 , 81:223.
[4] Mereno , MJ , Abad A , Pelegri R , et al. Validation of a monoclonal enzymeimmunoassay for the determination of caborfuran in fruits and vegetables[J]. Agric Food Chem,2001 , 49: 1713- 1719.
[5] 楊聯(lián)萍, 易學(xué)瑞, 李如冰, 等, 重組人再生增強因子 McAb 的建立與免疫組化定位研究 [J]. 中華微生物和免疫學(xué)雜志, 2001 , 21(1):86.
[6] Loomans E. Joural of immunological[J]. Methods, 1995 , 184:207- 217.
[7] Beatty JD. Journal of immunological[J]. Methods, 1987 , 100:173- 179.
( 收稿日期: 2008- 02- 14 )
2.3 抗體亞類
10 株雜交瘤細胞株, 其分泌的 McAb Ig 亞類結(jié)果見表 2 。
表 2 雜交瘤細胞株分泌的 McAb Ig 亞類
2.4 位點分析
通過 ELISA 疊加試驗對以上 10 株單抗進行位點分析,試驗發(fā)現(xiàn), 5 株單抗彼此疊加后的增值指數(shù)均大于 50% , 說明 5 株單抗的抗原識別位點均不相同。其中 McAb 7H5 和McAb 6E5 相互疊加的增值指數(shù)可達 96.8% , 配對良好。
2.5 親和常數(shù)測定
10 株雜交瘤細胞株, 選取其中 5 株進行親和常數(shù)的測定, 結(jié)果見表 3 。
表 3 雜交瘤細胞株親和常數(shù)
3 討論
獲得高質(zhì)量的單克隆抗體是檢測診斷試劑產(chǎn)品研制中最為基礎(chǔ), 也是最為主要的研究, 單抗的性能直接決定診斷試劑產(chǎn)品的質(zhì)量。而生物活性效價、抗原位點互補關(guān)系、親和常數(shù)及穩(wěn)定性是衡量一種單抗性能好壞最主要的性能指標,在單抗研究實踐中由于受諸多隨機因素影響, 要取得各項性能指標最優(yōu)難度較大。本文報道了 β2 - MG 單克隆抗體研究結(jié)果, 成功獲得了 10 株穩(wěn)定分泌抗人 β
2 - MG 單克隆抗體的雜交瘤細胞株, 經(jīng)鑒定 10 株單抗特異性好, 親和力強, 抗體分泌穩(wěn)定, 其中有 2 株在生物活性效價、抗原位點互補關(guān)系、親和常數(shù)及穩(wěn)定性達到了最佳, 為 β2 - MG 診斷試劑產(chǎn)品研制奠定了較好的基礎(chǔ)。
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[7] Beatty JD. Journal of immunological[J]. Methods, 1987 , 100:173- 179.
( 收稿日期: 2008- 02- 14 )
